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节目简介
来源：小宇宙
提到 RNAseq，我们默认想到的是已经广泛应用十多年的二代短读长 RNAseq。而如今，全长转录组测序正在从实验室走向临床。本期节目，我们从技术本身出发，聊聊长读长 RNA-seq 是什么、和短读长比到底强在哪，以及它在实际遗传病诊断中已经能做到什么——结合两篇 2026 年最新发表的临床队列研究，看看全长转录组在临床中的实用性如何。
本期内容
* 全长转录组测序的技术背景：短读长的三大局限，PacBio 与 ONT 平台的技术路线，以及 Iso-Seq 和 Kinnex 的关系
* HiFi Kinnex RNA-seq（EJHG, 2026）：全转录组方案在临床队列中的表现，球蛋白耗竭的反直觉结果，以及内含子保留、渗漏剪接、相位分析的实际案例 doi:10.1038/s41431-026-02042-9
* STRIPE（Science Advances, 2026）：靶向长读长 RNA-seq 如何实现单倍型分辨诊断，以及供体剪接位点变异激活隐性 PAS 的新机制 doi:10.1126/sciadv.ady9895
* 全长转录组的局限性和未来发展方向的探讨
术语列表
Long-read RNA-seq
全长转录组测序
对 RNA 分子从头到尾进行测序，获得完整的转录本序列，可同时获得剪接异构体信息和单倍型分辨。
Iso-Seq
PacBio 全长 RNA-seq 的标准操作框架，涵盖实验端（逆转录、扩增、去嵌合体）和生信端（比对、转录本重建、异构体分类），适用于历代 PacBio 测序仪。
Kinnex / MAS-seq
PacBio 2023 年推出的文库制备技术。将多个 cDNA 首尾串联成 concatamer 后测序，再由 skera 软件切分回原始片段，使 RNA 测序有效通量提升约一个数量级。Iso-Seq 是方法框架，Kinnex 是提升通量的文库策略，二者可结合使用。
Haplotype resolution
单倍型分辨
区分来自父母双方的两条等位基因（单倍型）的能力。短读长因片段太短往往无法实现，长读长可通过单条读长跨越多个变异位点完成相位分析（phasing）。
Cryptic PAS
隐性多聚腺苷酸化信号
内含子中本被 U1 snRNP 抑制的 poly(A) 信号。当供体剪接位点发生变异，U1 snRNP 无法正常结合，隐性 PAS 被激活，导致转录本在内含子处提前切割和多聚腺苷酸化，产生截短蛋白。
NMD
无义介导的 mRNA 降解
Nonsense-mediated mRNA decay，细胞降解含提前终止密码子的异常转录本的机制。导致部分致病转录本在常规 RNA-seq 中几乎检测不到，需要靶向深度覆盖或 cycloheximide（CHX）处理才能捕获。
Leaky splicing
渗漏剪接
纯合致病变异患者中仍可检测到少量正常剪接转录本的现象，提示剪接机器并未完全失效。可能解释相同基因型患者间临床表现的异质性。
VUS
临床意义不明确变异
Variant of Uncertain Significance，DNA 检测发现但缺乏足够功能证据判断致病性的变异。RNA-seq 可提供转录本层面的直接功能证据，有助于 VUS 的重新分类。
CDG / PMD
先天性糖基化障碍（Congenital Disorders of Glycosylation）和原发性线粒体病（Primary Mitochondrial Disease），本期 STRIPE 研究所涵盖的两类遗传代谢病，共涉及 466 + 359 个靶向基因。
参考文献
Wang R, Wang F, et al. Targeted long-read RNA sequencing for rare disease diagnosis and variant interpretation. Science Advances 12, eady9895 (2026). doi:10.1126/sciadv.ady9895
Jaramillo Oquendo C, Ferraro F, et al. HiFi long-read RNA sequencing enhances clinical diagnostics in rare disorders. European Journal of Human Genetics (2026). doi:10.1038/s41431-026-02042-9
Wang F, et al. TEQUILA-seq: A versatile and low-cost method for targeted long-read RNA sequencing. Nature Communications 14, 4760 (2023).
Al'Khafaji AM, et al. High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation. Nature Biotechnology 42, 582–586 (2024). [MAS-seq / Kinnex 原始方法文章]
Kaida D, et al. U1 snRNP protects pre-mRNAs from premature cleavage and polyadenylation. Nature 468, 664–668 (2010). [隐性 PAS 机制背景]
Yepez VA, et al. Clinical implementation of RNA sequencing for Mendelian disease diagnostics. Genome Medicine 14, 38 (2022).
Pardo-Palacios FJ, et al. Systematic assessment of long-read RNA-seq methods for transcript identification and quantification. Nature Methods 21, 1349–1363 (2024).
若对播客有任何问题或者投稿，或需要获得文字版音频总结，请联系我 [email protected]
小红书 / 微博：@撸森森
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本期内容
* 全长转录组测序的技术背景：短读长的三大局限，PacBio 与 ONT 平台的技术路线，以及 Iso-Seq 和 Kinnex 的关系
* HiFi Kinnex RNA-seq（EJHG, 2026）：全转录组方案在临床队列中的表现，球蛋白耗竭的反直觉结果，以及内含子保留、渗漏剪接、相位分析的实际案例 doi:10.1038/s41431-026-02042-9
* STRIPE（Science Advances, 2026）：靶向长读长 RNA-seq 如何实现单倍型分辨诊断，以及供体剪接位点变异激活隐性 PAS 的新机制 doi:10.1126/sciadv.ady9895
* 全长转录组的局限性和未来发展方向的探讨
术语列表
Long-read RNA-seq
全长转录组测序
对 RNA 分子从头到尾进行测序，获得完整的转录本序列，可同时获得剪接异构体信息和单倍型分辨。
Iso-Seq
PacBio 全长 RNA-seq 的标准操作框架，涵盖实验端（逆转录、扩增、去嵌合体）和生信端（比对、转录本重建、异构体分类），适用于历代 PacBio 测序仪。
Kinnex / MAS-seq
PacBio 2023 年推出的文库制备技术。将多个 cDNA 首尾串联成 concatamer 后测序，再由 skera 软件切分回原始片段，使 RNA 测序有效通量提升约一个数量级。Iso-Seq 是方法框架，Kinnex 是提升通量的文库策略，二者可结合使用。
Haplotype resolution
单倍型分辨
区分来自父母双方的两条等位基因（单倍型）的能力。短读长因片段太短往往无法实现，长读长可通过单条读长跨越多个变异位点完成相位分析（phasing）。
Cryptic PAS
隐性多聚腺苷酸化信号
内含子中本被 U1 snRNP 抑制的 poly(A) 信号。当供体剪接位点发生变异，U1 snRNP 无法正常结合，隐性 PAS 被激活，导致转录本在内含子处提前切割和多聚腺苷酸化，产生截短蛋白。
NMD
无义介导的 mRNA 降解
Nonsense-mediated mRNA decay，细胞降解含提前终止密码子的异常转录本的机制。导致部分致病转录本在常规 RNA-seq 中几乎检测不到，需要靶向深度覆盖或 cycloheximide（CHX）处理才能捕获。
Leaky splicing
渗漏剪接
纯合致病变异患者中仍可检测到少量正常剪接转录本的现象，提示剪接机器并未完全失效。可能解释相同基因型患者间临床表现的异质性。
VUS
临床意义不明确变异
Variant of Uncertain Significance，DNA 检测发现但缺乏足够功能证据判断致病性的变异。RNA-seq 可提供转录本层面的直接功能证据，有助于 VUS 的重新分类。
CDG / PMD
先天性糖基化障碍（Congenital Disorders of Glycosylation）和原发性线粒体病（Primary Mitochondrial Disease），本期 STRIPE 研究所涵盖的两类遗传代谢病，共涉及 466 + 359 个靶向基因。
参考文献
Wang R, Wang F, et al. Targeted long-read RNA sequencing for rare disease diagnosis and variant interpretation. Science Advances 12, eady9895 (2026). doi:10.1126/sciadv.ady9895
Jaramillo Oquendo C, Ferraro F, et al. HiFi long-read RNA sequencing enhances clinical diagnostics in rare disorders. European Journal of Human Genetics (2026). doi:10.1038/s41431-026-02042-9
Wang F, et al. TEQUILA-seq: A versatile and low-cost method for targeted long-read RNA sequencing. Nature Communications 14, 4760 (2023).
Al'Khafaji AM, et al. High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation. Nature Biotechnology 42, 582–586 (2024). [MAS-seq / Kinnex 原始方法文章]
Kaida D, et al. U1 snRNP protects pre-mRNAs from premature cleavage and polyadenylation. Nature 468, 664–668 (2010). [隐性 PAS 机制背景]
Yepez VA, et al. Clinical implementation of RNA sequencing for Mendelian disease diagnostics. Genome Medicine 14, 38 (2022).
Pardo-Palacios FJ, et al. Systematic assessment of long-read RNA-seq methods for transcript identification and quantification. Nature Methods 21, 1349–1363 (2024).
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